蛋白酶 K

简介

蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。该酶在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70degC)均有活性，用于质粒或基因组 DNA、RNA的分离。

性质

蛋白酶K能消化天然的角蛋白（Kerati），而得名蛋白酶K。其主要的切割位点是脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。由于其广泛地的切割能力，在实验室中很常用。此蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶SB超家族中的S8家族（枯草杆菌蛋白酶也属于这个超家族）。蛋白酶K的分子量为28.9千道尔顿。

酶活性

蛋白酶 K的酶活力，gt30U/mg。在37℃，以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1微摩尔酪氨酸Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。 在很宽的pH范围内有效，有效的pH范围为pH4.0-12.5，最佳pH范围为pH7.5-8.0。 蛋白酶K的最佳反应温度为65℃，但在65℃或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多时候反应温度选择50 -55℃。

应用

蛋白酶K时常应用于分子生物学领域。在制备核酸时，蛋白酶K可以将杂蛋白去除，并迅速使核酸酶失活，避免其降解目标产物DNA和RNA。另外，蛋白酶K还有其他优点，它在变性剂存在下仍能保有活性，如SDS、尿素、EDTA等等，这点与其他蛋白酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）相当不同。

用途

蛋白酶K由于能够消化角蛋白（kratin）因此被命名为蛋白酶K。蛋白酶K家族包含了各种由真菌、酵母及革兰氏阴性细菌分泌的细胞内肽酶，其中细菌分泌的酶有高度的序列相似性（gt55%）。林伯氏白色念球菌（Tritirachiumalbum Limber）分泌产生蛋白酶K是该家族的模式蛋白。蛋白酶K对大多数底物均有切割活性，但是偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链。其属于丝氨酸蛋白酶，拥有典型的丝氨酸活性位点：Asp39ndashHis69ndashSer224 。其含有一个单练肽链包含277氨基酸位点，并拥有2个二硫键和一个空置的半胱氨酸位点以及两个钙离子结合位点。
蛋白酶K的应用主要为核酸提取时去除DNA酶和RNA酶，并且可将结合于基因组上的组蛋白去除，还可用于碱性磷酸酶的失活。目前分子生物学技术已应用于许多检测标准中，例如转基因检测、动物属性检测、致病微生物检测等。在分子生物学检测中核酸的提取质量直接影响了后续PCR反应的扩增效率。许多标准在核酸提取步骤中都设立了添加蛋白酶K消化的步骤，以期提取较纯的核酸。为了保护核酸，分子生物学核酸提取实验中通常含有EDTA等试剂，由于EDTA可以与金属离子络合，因此可能会导致酶活性受到影响并且通常为pH8.0时和55℃条件下进行消化，不同pH值和温度条件会使得酶活性受到影响。

用途

分离DNA和RNA期间使核苷酸酶蛋白失活。去除内毒素对阳离子蛋白的约束，如溶菌酶和核糖核酸酶。研究报告显示用于分离肝，酵母，绿豆线粒体测定细胞膜上的酶用于抗体标记，石蜡包埋组织切片中暴露抗原结合位点。消化脑组织样本中的蛋白质，用于朊病毒的传染性海绵状脑病（TSE）的研究